Dopo le soppressioni di chiese e conventi tra Sette e Ottocento, giunsero agli Uffizi numerosi opere di provenienza ecclesiastica, mentre agli inizi del Novecento vennero acquisiti alcuni importanti dipinti. Tra i capolavori esposti: le grandi pale d’altare di Cimabue e Giotto; opere del Trecento senese (tra le quali spicca l’Annunciazione di Simone Martini); una ricchissima panoramica sul Quattrocento in Toscana e nell’Italia centrale (dalla Madonna con Bambino e Sant’Anna di Masaccio e Masolino, a Filippo Lippi e a Botticelli, con la Nascita di Venere e la Primavera, da Piero della Francesca, con i Ritratti dei duchi di Urbino a l’Adorazione dei Magi di Gentile da Fabriano).

Le sale dedicate alla pittura del Cinquecento riuniscono i maestri delle maggiori scuole italiane: dall’Adorazione dei Magi di Leonardo da Vinci, a Michelangelo e Raffaello; Tiziano, con la Venere di Urbino, insieme a Veronese e Tintoretto testimonia la grande stagione della pittura veneta; non mancano gli artisti di altri paesi, da Albrecht Dürer a Hans Holbein, fino a El Greco. Il Bacco di Caravaggio apre la serie di opere seicentesche, ricca di pezzi provenienti dalle più importanti scuole europee, da Rubens a Van Dyck, agli Autoritratti di Rembrandt; infine, Canaletto e Guardi, insieme con Longhi e Tiepolo, offrono una panoramica sul Settecento. La galleria ospita inoltre sculture antiche, miniature e arazzi provenienti dalle collezioni medicee. Sono in corso i lavori per la realizzazione dei Nuovi Uffizi, che porteranno al raddoppio della capacità espositiva, consentendo la visione di opere finora non accessibili al pubblico.